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NEB T4 DNA連接酶protocol:
1、在微型離心管(冰上)中設置以下反應：
（T4 DNA連接酶應最后添加。注意：表中顯示了使用1mol:3mol插入zhi定DNA大小的載體的連接。）
成分 | 20 μl 反應 |
T4 DNA連接酶緩沖液 (10X)* | 2 μl |
載體 DNA (4 kb) | 50 ng (0.020 pmol) |
Insert DNA (1 kb) | 37.5 ng (0.060 pmol) |
無核酸酶水 | to 20 μl |
T4 DNA 連接酶 | 1 μl |
**注意：T4 DNA連接酶緩沖液應在室溫下解凍并重懸。
2、通過吸管上下輕輕混合反應物，并短暫地進行微量離心。
3、對于粘性（粘性）末端，在16°C下孵育過夜或室溫下孵育10分鐘。
4、對于鈍端或單堿基懸突，在16°C下孵育過夜或室溫下孵育2小時（或者，高濃度T4 DNA連接酶可用于10分鐘的連接）。
5、在65°C下加熱滅活10分鐘。
6、在冰上冷卻，將1-5μl的反應轉化為50μl的感受態細胞。
NEB T4 DNA連接酶使用時的注意事項：
1、ATP 是反應中必不ke少的輔因子。這與需要 NAD 作為輔因子的 E. coli DNA 連接酶不同。
2、若需稀釋 T4 DNA 連接酶，推薦使用含 50% 甘油的貯存緩沖液（稀釋緩沖液 A，NEB #B8001S）稀釋，然后于 -20℃ 貯存。如稀釋后立即使用，也可以使用 1X T4 DNA 連接酶反應緩沖液稀釋。
3、連接反應可以在添加 1 mM ATP 的四種限制性內切酶緩沖液的任何一種或在 T4 多聚核苷酸激酶（T4 PNK）緩沖液中進行。
4、室溫連接。
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