高效液相色譜純化小鼠腹水中單克隆抗體的原理、步驟、注意事項(xiàng)

原理

根據(jù)離子交換原理，將經(jīng)硫酸銨粗提的含McAbγ球蛋白上樣結(jié)合于層析柱上，通過增加洗脫液中的離子強(qiáng)度，洗脫并收集蛋白峰。

材料與儀器

PBS
緩沖液
層析柱 高效液相色譜儀

步驟

1. 腹水10000 g離心10 min，除去細(xì)胞和雜質(zhì)，在4 ℃條件下逐滴加入飽和硫酸銨溶液，使終濃度為40 ％飽和硫酸銨攪拌20～30 min

2. 離心，沉淀用40 ％飽和硫酸銨洗滌2次后溶于PBS，對緩沖液A（PH8.5 20 mM Tris緩沖液）透析除鹽4 ℃過夜

3. 用帶有1000 μl樣品環(huán)的高壓加樣活門將透析后粗提物加樣于經(jīng)緩沖液A液平衡的TSK DEAE SPW離子交換層析柱

4. 洗脫流速1 ml/min

0～1 min：0→5％緩沖液B（20 mM Tris，PH8.5，含2.0 M醋酸鈉）

1～20 min（線性梯度洗脫）：5→20％緩沖液B

20～22 min：20→0％緩沖液B

5. 洗脫液用紫外280 nm進(jìn)行監(jiān)測

6. 收集蛋白峰，進(jìn)行含量、純度和活性測定

注意事項(xiàng)

1. 所用緩沖液和加樣粗提物均需0.22 μm濾膜過濾。

2. 在本實(shí)驗(yàn)條件下，IgG1峰一般在線性梯度洗脫開始11～12 min。但不同類和亞類抗體以及不同特異性McAb的存留時(shí)間（retention time）有所差異。

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