免疫印跡法（WB）抗體純化的原理、步驟與注意事項

原理

免疫印跡法（Western Blot，WB）是一種通過識別蛋白質的特定抗原性進行檢測和分析的方法，可用于抗體純化。在免疫印跡法中，通過利用蛋白質的親和性和特異性，將抗血清中的待純化抗體與其所特異結合的抗原分離出來。

用途

降低非特異性本底。

材料與儀器

免疫抗原、抗血清、PVDF 膜、電泳膠

電泳液、轉膜液、預染蛋白 Marker

5% 脫脂牛奶、PBST、電泳儀、電轉槽、搖床

步驟

利用 western blot 進行抗體純化的步驟如下：

1、上樣蛋白準備。將免疫抗原作為上樣蛋白進行備樣，設置 3 個不同濃度的上樣量（2 ug、4 ug、6 ug），以便后續可通過不同量的蛋白泳道孵育出的深淺不同驗證抗體特異性。

2、點樣及電泳。根據免疫抗原的分子量大小配置適合的電泳膠（8%～15%），以能明確看到免疫抗原位置為準，進行電泳。120 V 恒壓，90～120 min 至藍色指示帶跑到接近膠板下緣。

3、轉膜。先把膠用劃刀裁至合適大小，再根據膠大小裁剪合適的 PVDF 膜，手不要接觸轉膜紙，將毛氈墊、吸水棉分放在夾板兩邊，將膠放在黑色夾板上面，上面覆上 PVDF 膜，趕盡氣泡，夾緊后放入轉膜盒。將整個轉膜設備放入預先備好的冰塊的盆中。設置條件：350 mA 恒流 90 min。

4、封閉。轉膜結束后，將 PVDF 膜取出放在 5% 脫脂牛奶中封閉 1 小時。用 PBST 漂洗 3 次，每次 5 min。

5、孵育一抗。這里用抗血清作為一抗進行孵育，建議進行 1:100 稀釋后使用， PVDF 膜浸潤，搖床 4 ℃ 過夜。第二天 PBST 漂洗 3 次。

6、孵育二抗。加入 1:3000 稀釋的 HRP 標記的羊抗兔 IgG 二抗將 PVDF 膜充分浸潤，室溫孵育 1 小時，漂洗 3 次。

7、顯影。將顯影液按比例預先混合好，PVDF 膜平鋪在塑料膜上，蛋白面朝上，將混合好的顯影液均勻地滴在上面。利用 Image Quant LAS 4000 mini 顯影儀顯影。此時如有蛋白條帶在免疫抗原位置顯示出來，并根據蛋白量的不同有深淺之分，則說明抗血清中抗體滴度高，特異性強。

注意事項

1, 若免疫抗原是自己提純的蛋白，則要保證蛋白的純度，盡可能提高蛋白的純度。

2, 提前搜索目的蛋白的分子量大小，根據分子量大小選擇電泳膠的濃度。可以參考 marker 說明書，最好讓蛋白跑在膠中間的位置。

3, 轉膜的時候注意膠和膜的上下關系，不要轉反，如果轉反了，即便抗體是好用的，實驗結果也是陰性的。

常見問題

1. 免疫抗原一般為人工合成的蛋白，本方法只能說明免疫動物后產生了抗免疫抗原的抗體，并不能說明產生了抗天然蛋白的抗體，如需驗證所產生抗體是否可與天然蛋白結合，需將上樣液中的免疫抗原更換為天然抗原，純度不高沒有關系，有一定量即可。

2. 抗血清的稀釋是為了保證所產生的待測抗體滴度足夠高，從而便于后續純化收集，如只想驗證有無，也可以用抗血清原液進行孵育。

3. 如此方法中免疫抗原與抗血清無法結合，可利用 ELISA 進行檢測，因為 WB 中的蛋白為線性蛋白，空間結構與天然有所差別，會有影響。

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