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賽默飛Lipofectamine 2000轉染試劑（貨號11668019）應用全攻略：從入門到精通
Lipofectamine 2000是賽默飛世爾推出的明星級陽離子脂質體轉染試劑，廣泛用于DNA/RNA的哺乳動物細胞遞送。其核心優勢體現在：
· 高轉染效率：適用于貼壁細胞（HEK293、HeLa）和懸浮細胞（CHO、Jurkat），DNA轉染效率可達85%-95%（數據來源：Thermo Fisher Protocol）
· 低細胞毒性：通過優化脂質體結構，48小時培養后細胞存活率≥90%
· 多場景適配：支持質粒DNA、siRNA、miRNA及CRISPR/Cas9系統共轉染
1. 試劑準備
· 稀釋DNA：需保持無菌環境，推薦使用Opti-MEM培養基（貨號31985070）將DNA稀釋至0.5-2 μg/μL
· 脂質體混合：Lipofectamine 2000與稀釋液比例為1:25（如：1 μL試劑+24 μL培養基）
2. 復合物形成
· 將脂質體稀釋液與DNA稀釋液按1:1體積混合
· 關鍵步驟：室溫靜置20分鐘，形成穩定脂質體-DNA復合物（時間偏差＞5分鐘會導致效率下降10%-15%）
3. 細胞處理
· 貼壁細胞需達到70%-80%融合度
· 每孔加入100 μL復合物，37℃孵育6小時后換液
| 細胞類型 | DNA用量 (μg) | 脂質體比例 | 特殊處理 |
| HEK293 | 0.8 | 1:2.5 | 無血清培養基轉染 |
| 原代神經元 | 0.5 | 1:1 | 預鋪層粘連蛋白（20 μg/mL） |
| 懸浮CHO | 1.2 | 1:3 | 轉染后16小時添加10% FBS |
1. 轉染效率低
· 排查方向：DNA純度（OD260/280需在1.8-2.0）、細胞狀態（傳代次數≤15）
· 優化方案：添加增強劑（如PlasmidPlus，貨號A31852）
2. 細胞毒性顯著
· 原因分析：脂質體過量或孵育時間過長
· 改進措施：將轉染時間縮短至4小時，DNA濃度降低30%
3. RNA干擾效率不佳
· 技術要點：siRNA終濃度控制在20-50 nM，推薦使用Silencer Select系列（貨號4392420）
· 驗證方法：設置Cy3標記siRNA對照組，熒光顯微鏡觀察攝取效率
Protocol亮點：
· Cas9質粒與sgRNA質量比采用1:3（如 1 μg : 3 μg）
· 共轉染熒光報告系統（如pEGFP-N1，貨號6085-1）
· 使用流式細胞術篩選后，基因編輯效率提升40%（參考文獻：Nat Methods 2016）
存儲條件：4℃避光保存，避免反復凍融（凍融超3次活性下降50%）
有效期驗證：開封后6個月內使用，每月進行轉染陽性對照實驗
質控標準：每批次均通過HEK293細胞轉染測試，EGFP表達率≥85%
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